Los espectrofotómetros permiten medir cuánta luz absorbe una sustancia química, ycada sustancia química absorbe la luz de una manera diferente, que depende de la estructura de sus moléculas.
El principio utilizado es la medición de la intensidad de la luz, cuando un haz luminoso pasa a través de una muestra y se basa en la ley de Beer-Lambert, que dice que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Así, la energía que produce una fuente luminosa sobre una superficie es directamente proporcional a la intensidad de la fuente y al coseno del ángulo que forma la normal a la superficie con la dirección de los rayos de luz, y es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia a dicha fuente.
La energía de las ondas electromagnéticas está relacionada con sus longitudes de onda; cuanto más corta es la longitud de onda, mayor es la energía. Así, la luz violeta tiene una longitud de onda más corta que la luz roja y, por lo tanto, un nivel de energía más alta, mientras que la infrarroja tiene menos energía que la luz visible debido a su mayor longitud de onda.
Se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta de 180 a 380 nm y visible de 380 a 800 nm del espectro (se denomina espectro a todos los componentes de todas las longitudes de onda). La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante.
A continuación, te explicamos las principales diferencias entre los espectrofotómetros de barrido, de matriz y los de haz simple o doble.
- Espectrofotómetros de barrido
En un espectrofotómetro de barrido o escáner, la luz dispersada en longitudes de onda individuales se selecciona mediante una rejilla, que gira mecánicamente y mide la transmitancia individual de cada longitud de onda a través de la cubeta. De este modo, se obtiene todo el espectro de forma continua.
En algunos casos, el escaneo con espectrofotómetros de barrido puede producir una disminución en la precisión y reproducibilidad de la selección de longitud de onda.
- Espectrofotómetros de matriz (array)
Aquí la muestra está iluminada por un haz de luz UV/VIS, que contiene todo el espectro. De esta forma, la muestra absorbe simultáneamente las diferentes longitudes de onda de luz. La luz transmitida es difractada por una rejilla de reflexión, situada después de la cubeta. A continuación, la luz es dirigida a un detector, compuesto por diversos materiales fotosensibles, lo que permite la medición simultánea de todas las longitudes de onda. Al sistema de espectrofotómetros de matriz también se le conoce como "óptica inversa" y tiene la ventaja que no dispone de partes móviles y la medida es más rápida y fiable.
- Espectrofotómetros UV/VIS de haz simple o doble
En espectrofotómetros de haz simple, el haz de luz originado en la lámpara se guía directamente a través de la cubeta de muestra hasta el detector.
En cambio, en la configuración de espectrofotómetros de doble haz, el haz de luz de la lámpara se divide en dos haces de intensidades iguales: un haz de referencia y un haz de muestra. Cada haz pasa por una cubeta diferente, la de referencia (con el solvente) y la de muestra, de forma simultánea.
Las intensidades de ambos haces se miden al mismo tiempo mediante dos detectores (o fotodiodos). En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la de referencia.
En mediciones por debajo de 300 nm, hay que tener en cuenta el valor de absorbancia de los solventes, que puede ser alta. Esto puede originar errores, puesto que la absorción debida a la muestra es pequeña en comparación con la absorción total.
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