El principio de la espectrofotometría
El principio utilizado es la medición de la intensidad de la luz, cuando un haz luminoso pasa a través de una muestra. Cada sustancia química absorbe la luz de una manera diferente, que depende de la estructura de sus moléculas.
En química analítica, la medición de la intensidad de la luz con espectrofotómetros permite determinar concentraciones de compuestos –ya sean moléculas orgánicas o iones inorgánicos–, constantes de disociación de indicadores ácido-base, identificar unidades estructurales específicas, calcular el punto de fusión de proteínas y ácidos nucleicos, determinar el coeficiente de extinción de una muestra, efectuar medidas cinéticas (velocidades de reacción) e, incluso, analizar materiales sólidos, como films o partes de vidrio.
Ley de Beer-Lambert
El principio de la espectrofotometría se basa en la ley de Beer-Lambert, que dice que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Así, la energía que produce una fuente luminosa sobre una superficie es directamente proporcional a la intensidad de la fuente y al coseno del ángulo que forma la normal a la superficie con la dirección de los rayos de luz, y es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia a dicha fuente.
En la espectrofotometría, se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta de 180 a 380 nm y visible de 380 a 800 nm del espectro (se denomina espectro a todos los componentes de todas las longitudes de onda). La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante.
La energía de las ondas electromagnéticas está relacionada con sus longitudes de onda; cuanto más corta es la longitud de onda, mayor es la energía. Así, la luz violeta tiene una longitud de onda más corta que la luz roja y, por lo tanto, un nivel de energía más alta, mientras que la infrarroja tiene menos energía que la luz visible debido a su mayor longitud de onda.
Partes de un espectrofotómetro
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Lámpara
Para llevar a cabo una espectrofotometría, se necesita una fuente de luz, que iluminará la muestra y que debe ser estable y direccionable, con distribución de energía espectral continua y larga vida.
Existen 4 tipos de lámparas diferentes que se utilizan con espectrofotómetros:
- Wolframio, también denominadas de tungsteno
- Arco de xenón
- Deuterio
- LED
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Monocromador
En los espectrofotómetros, también encontramos un monocromador. Este sistema es una lente que se utiliza para que el haz de luz entrante pase a través de un prisma, que separa todas las longitudes de onda de ese haz. Un colimador, situado entre las rendijas de entrada y salida del haz de luz, obtiene un "haz" paralelo (o luz colimada), que aísla las radiaciones de longitud de onda deseadas.
Existen diversas variaciones del sistema monocromador, según cada fabricante de espectrofotómetros.
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Compartimento para la medida
En este espacio de los espectrofotómetros se insertan las cubetas de medida, donde tiene lugar la interacción con la muestra a analizar. Es importante que dicha interacción se produzca en un entorno sin absorción ni dispersión de las longitudes de onda. Los fotodetectores captan las radiaciones de todo el espectro y transmiten la señal para su determinación.
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Celdas
En estos recipientes se depositan las muestras líquidas a analizar. Las celdas de los espectrofotómetros disponen de 2 paredes, correspondiente a los lados ópticos por donde atraviesa el haz de luz. Normalmente, para medidas en el espectro visible, se utilizan celdas de vidrio o incluso de plástico, mientras que, para el espectro ultravioleta, éstas deben ser de cuarzo. Asimismo, existen celdas especiales para micromuestras o para materiales sólidos tipo óptico.
Cómo medir cuánta luz absorbe una sustancia con espectrofotómetros
En primer lugar, hemos de efectuar un llamado “blanco”. En el sector químico, un blanco es el resultado de la medición del solvente a utilizar con el producto, que se introduce en la cubeta de medición.
Para determinar una muestra con espectrofotómetros:
- Se disuelve una muestra en el solvente y se agrega a la cubeta.
- El haz de luz emitido pasa a través de la cubeta con la muestra, y la luz es parcialmente absorbida por las moléculas de la muestra en la solución.
- El detector mide la luz transmitida.
- El cambio de intensidad de luz en diferentes longitudes de onda se calcula dividiendo la intensidad transmitida de la solución de muestra por los valores correspondientes del blanco. Finalmente, esta relación queda almacenada.
Transmitancia y absorbancia en espectrofotometría
La intensidad de la luz transmitida a través de la solución es atenuada debido a la absorción de luz, y su valor es más bajo que la intensidad original I0 en la fuente de luz. La relación entre las dos intensidades It / I0 se define como la transmitancia T, que es el valor determinado principal y su unidad se expresa en %.
Otra forma de expresar el resultado es la absorbancia, que se define como A = −log (T), es decir, el logaritmo negativo del valor de transmitancia. La absorbancia “A”, no tiene ninguna unidad de medida (es un valor adimensional) y se conoce como “UA” (unidades de absorbancia).
Tipos de espectrofotómetros
En LabProcess contamos con una amplia gama de espectrofotómetros, como los ONDA, por ejemplo. A continuación, te explicamos las principales diferencias entre los espectrofotómetros de barrido, de matriz y los de haz simple o doble.
Espectrofotómetros de barrido
En un espectrofotómetro de barrido o escáner, la luz dispersada en longitudes de onda individuales se selecciona mediante una rejilla, que gira mecánicamente y mide la transmitancia individual de cada longitud de onda a través de la cubeta. De este modo, se obtiene todo el espectro de forma continua.
En algunos casos, el escaneo con espectrofotómetros de barrido puede producir una disminución en la precisión y reproducibilidad de la selección de longitud de onda.
Espectrofotómetros de matriz (array)
Aquí la muestra está iluminada por un haz de luz UV/VIS, que contiene todo el espectro. De esta forma, la muestra absorbe simultáneamente las diferentes longitudes de onda de luz. La luz transmitida es difractada por una rejilla de reflexión, situada después de la cubeta. A continuación, la luz es dirigida a un detector, compuesto por diversos materiales fotosensibles, lo que permite la medición simultánea de todas las longitudes de onda. Al sistema de espectrofotómetros de matriz también se le conoce como "óptica inversa" y tiene la ventaja que no dispone de partes móviles y la medida es más rápida y fiable.
Espectrofotómetros UV/VIS de haz simple o doble
En espectrofotómetros de haz simple, el haz de luz originado en la lámpara se guía directamente a través de la cubeta de muestra hasta el detector.
En cambio, en la configuración de espectrofotómetros de doble haz, el haz de luz de la lámpara se divide en dos haces de intensidades iguales: un haz de referencia y un haz de muestra. Cada haz pasa por una cubeta diferente, la de referencia (con el solvente) y la de muestra, de forma simultánea.
Las intensidades de ambos haces se miden al mismo tiempo mediante dos detectores (o fotodiodos). En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la de referencia.
En mediciones por debajo de 300 nm, hay que tener en cuenta el valor de absorbancia de los solventes, que puede ser alta. Esto puede originar errores, puesto que la absorción debida a la muestra es pequeña en comparación con la absorción total.
